本文是学习GB-T 34793-2017 蛋白酶K. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了蛋白酶 K
产品的术语和定义、技术要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输及
贮存。
本标准适用于生化试剂蛋白酶 K 产品的生产和检测。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 191 包装储运图示标志
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 34800 蛋白酶K 酶活力及杂质检测方法
GB/T 34222 核糖核酸酶活力检测方法
GB/T 34801 脱氧核糖核酸酶活力检测方法
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
蛋白酶 K proteinase K
能水解天然角蛋白(keratin)的一种丝氨酸蛋白酶。
注：按产品形态分为固态和液态。
3.2
蛋白酶 K 酶活力单位 proteinase K activity
unit
在57℃和pH8.0 条件下，在1 min 内水解牛血红蛋白产生1μmol
酚基氨基酸的酶量。
注： 一个酶活力单位以U 表示。
应符合表1的规定。
表 1 感官要求
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GB/T 34793—2017
表 1 (续)
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应符合表2的规定。
表 2 理化指标
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取适量试样，在自然光线下，观察试样的色泽和状态，有无外来杂质，并记录。
按 GB/T 34800 检测。
按 GB/T 34222 检 测 。
按 GB/T 34801 检测。
使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定，见附录 A。
同一工艺周期生产，质量均一的产品为一批。
GB/T 34793—2017
从每批产品中随机抽取样品，取样总量不少于4个最小包装。
每批产品出厂前应进行检验，检验合格的产品方可出厂。出厂检验项目包括感官要求、蛋白酶
K
酶活力和蛋白酶 K 相对分子质量。
6.4.1
正常生产时，每半年应进行一次型式检验，有下列情况之一时，应进行型式检验：
a) 新产品试制鉴定时；
b) 正常生产后，如原料、工艺、设备有较大变化，可能影响产品性能时；
c) 产品停产半年以上恢复生产时；
d) 出厂检验结果与上次型式检验有较大差异时；
e) 监督机构提出要求时。
6.4.2 型式检验项目为第4章规定的所有项目。
6.5.1.1
出厂检验项目全部符合本标准，判定本批为合格品。
6.5.1.2
出厂检验项目不超过2项(含2项)不符合本标准，可以加倍复检，复检后如仍有1项不符合本
标准，则判定该批为不合格品。
6.5.1.3
出厂检验项目超过2项不符合本标准，判定该批产品为不合格品。
6.5.2.1 型式检验项目全部符合本标准，判为合格品。
6.5.2.2
型式检验项目不超过3项(含3项)不符合本标准，可以加倍复检，复检后如仍有1项不符合本
标准，则判定该批为不合格品。
6.5.2.3
型式检验项目超过3项不符合本标准，判定该批产品为不合格品。
包装储运标识应符合GB/T 191 的规定。
包装容器应整洁、卫生、无破损，并应符合相应的规定。
运输工具应清洁卫生。应在0℃~8℃环境下运输，避免受潮、受压、暴晒。装卸时，应轻拿轻放，
不得直接钩扎外包装。
本品应储存在阴凉、干燥、清洁、0℃~8℃环境内，严防日晒雨淋，严禁火种。
GB/T 34793—2017
(规范性附录)
蛋白酶 K 相对分子质量测定方法
A.1 原 理
十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称 SDS-PAGE。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的 十二烷基硫酸钠(SDS)
和还原剂(如β巯基乙醇),蛋白质样品就会改变天然构象，并与 SDS 结合形成带负
电荷的复合物，此时，蛋白质在电泳中的迁移率就取决于它的相对分子质量。根据标准蛋白质样品在电泳
中的迁移率和相对分子质量所作出的标准曲线，就可以推算出蛋白质样品相对分子质量的近似值。
A.2 仪器和设备
A.2.1 电泳系统。
A.2.2 电子天平，精度为0.0001g、0.01 g、0.1 g。
A.2.3 pH 计，精度为0.1 pH 单位。
A.3 试剂和溶液
本方法所用试剂均为分析纯，实验用水均为GB/T 6882规定的二级水。
A.3.1 30% 丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺溶液(Acr-Bis)
取丙烯酰胺(Acr)30.0 g,亚甲基双丙烯酰胺(Bis)0.8 g,加入60 mL
水，充分搅拌溶解，定容到 100 mL。用0.45 μm
微孔滤膜过滤除菌和杂质后储于棕色瓶，4℃避光保存。如有沉淀应过滤，两个月
后溶液应重新配制备用。
A.3.2 0.5 mol/L
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液(Tris-HCI),pH 6.8
取6.06 g 三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于80mL 的水中，充分搅拌溶解，用 HCl
调 pH 值为6.8,定
容至100 mL,4 ℃可保存1个月。
A.3.3 1.5 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液(Tris-HCl),pH
8.8
取18.2 g 三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于60 mL 的水中，充分搅拌溶解，用 HCl
调 pH 值为8.8,定
容至100 mL,4 ℃可保存1个月。
A.3.4 10% 十二烷基磺酸钠(SDS) 溶液
取2.0 g 十二烷基磺酸钠溶于约16 mL 的水中，超声溶解后定容至20 mL,
室温保存备用。
A.3.5 10% 过硫酸铵(APS) 溶液
取1.0 g 过硫酸铵，溶于10 mL 水中，现配现用。
A.3.6 4× 十二烷基磺酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
加样缓冲液
在25 mL0.5 mol/L pH6.8 的 Tris-HCl 缓冲液中加入15 mL 甘油，4.0 g
SDS,0.0250g溴酚蓝和
GB/T 34793—2017
5 mLβ-疏基乙醇，加水定容至50 mL。
A.3.7 电泳缓冲液
取 Tris 3.0 g,甘氨酸14.4 g,SDS1.0g, 加水溶解，用水定容至1000 mL。
A.3.8 固定液
在400 mL 乙醇中加入100 mL 冰醋酸，加水定容至1000 mL。
A.3.9 染色液
取0.05 g 考马斯亮蓝 R2500.50g, 加入500 mL 甲醇，100 mL
冰乙酸，加水定容至1000 mL。
A.3.10 脱色液
在500 mL 甲醇中加入100 mL 冰乙酸，加水定容至1000 mL。
A.3.11 标准蛋白质
相对分子质量为12 kDa～70kDa
的低相对分子质量标准蛋白质6种。也可使用相应相对分子质
量范围的商品化的预染低相对分子质量标准蛋白质试剂盒。
A.3.12 蛋白酶 K 样品溶液
取待测固体蛋白酶 K 制剂0.0100 g,加入10 mL 水，为1 mg/mL 蛋白酶 K
溶液。对于液体蛋白
酶 K 制剂，加水稀释至1 mg/mL 蛋白酶 K 溶液，4℃储存。
A.4 分析步骤
A.4.1 安装电泳槽
认真清洗制胶玻璃板，干燥后将两块玻璃板在电泳槽上装好。
A.4.2 灌制分离胶
按表 A.1
配制12%分离胶溶液，混匀后立即将分离胶溶液沿夹层中一条垫片的边缘加入两块玻璃
板之间，至凝胶约11 cm
高为止。然后，立即向夹层的液面上轻轻加入一层厚约1 cm 水。此时，水和分
离胶溶液的界面逐渐消失，室温下静置约30 min～60 min
后，由于凝胶聚合，界面又清晰可见，然后再
放置10分钟，使凝胶充分聚合。
表 A.1 分离胶的配制
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| 30% Acr-Bis |
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GB/T 34793—2017
A.4.3 灌制浓缩胶
将分离胶上面的水倾出，用滤纸吸干。按表 A.2
配制浓缩胶溶液，混匀后沿一条垫片灌入两玻璃 板之间，至离夹层的顶端约1 cm
高为止。将0.75 mm 厚的样品梳插入两玻璃板之间的浓缩胶溶液中。
静置约30 min～45
min,浓缩胶即可聚合。轻轻拔出样品梳，避免撕裂凝胶加样孔。
表 A.2 浓缩胶的配制
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A.4.4 蛋白酶 K 样品的准备
取蛋白酶 K 样品溶液，用4×的上样缓冲液按3:1混合，100℃煮沸3 min～5
min,静置，冷却至
室温。标准蛋白质无需加上样缓冲液，直接沸水浴3 min～5 min,冷却至室温。
A.4.5 加样
将电泳缓冲液加入到电泳槽中，至刚好淹没加样孔。用10 μL
规格的微量移液器，将预处理之后标 准蛋白质和蛋白酶 K
样品分别加到加样孔内，每个加样孔10μL, 小心加样，使样品在孔的底部成一薄
层。如有空置的加样孔，应加等体积的1×样品缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散。
A.4.6 电泳
将正、负电极与电泳仪的连线接好，开始电泳。开始电泳时，将电压调至80 V;
当示踪染料溴酚蓝 进入分离胶后，将电压调至200 V;
当示溴酚蓝迁移至距凝胶下沿约1.5 cm 时，将电压调回零，关掉电
源，停止电泳。
A.4.7 固定、染色和脱色
倾去电泳缓冲液，
一并取下两块玻璃板。将凝胶定位以便识别加样的顺序。用胶片或刀片轻轻撬
开两块玻璃板，凝胶保留在一块玻璃板上。在盛有固定液的容器中，将胶面与玻璃板分开，把凝胶转入
固定液中，标记溴酚蓝迁移位置，固定1 h。
然后，倒去固定液，加入染色液，染色1 h。 倾去染色液，用
水把凝胶漂洗几次。最后，将凝胶转移到脱色液中，期间更换脱色液数次，至背景脱色、蛋白质条带清晰
为止。
A.4.8 结果与分析
根据标准蛋白质样品在电泳中的相对迁移率和相对分子质量所作出的标准曲线就可以推算出蛋白
质样品相对分子质量的近似值。
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